1 原理及用途
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)尿樣、組織、飼料等樣本中的萊克多巴胺(Ractopamine,Rac),試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí),加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,樣本中的萊克多巴胺和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗萊克多巴胺抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光度值與其所含萊克多巴胺含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中萊克多巴胺的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度:0.1ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式:25℃,30min~15min。
2.3 檢測(cè)下限:
尿液樣本………………………………0.1ppb
組織(處理方法一)…………………0.4ppb
肌肉樣本(處理方法二)……………0.1ppb
肝臟樣本(處理方法二)……………0.2ppb
飼料樣本………………………………1ppb
2.4 交叉反應(yīng)率:
萊克多巴胺 ………………………… 100%
多巴酚丁胺……………………………< 1%
克倫特羅………………………………<0.1%
沙丁胺醇………………………………<0.1%
2.5 樣本回收率:
尿樣………………………………………95%±10%
組織………………………………………90%±15%
飼料………………………………………90%±15%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板…………………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液(綠蓋):各1ml
0ppb,0.1ppb,0.3ppb,0.9 ppb,2.7ppb,8.1ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液(紅蓋):100ppb……………1ml
酶標(biāo)記物 (紅蓋)…………………………5.5ml
抗體工作液 (藍(lán)蓋)………………………9ml
底物液A (白蓋)…………………………6ml
底物液B(黑蓋)……………………………6ml
終止液(黃蓋)……………………………6ml
20X濃縮洗滌液(透明蓋)………………40 ml
10X復(fù)溶液(黃蓋)………………………50 ml
說(shuō)明書(shū)………………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器:酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)
4.2 微量移液器:?jiǎn)蔚?0µl-200µl,100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑:正己烷、乙腈、甲醇、無(wú)水硫酸鈉
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知:
實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液:
配液1:復(fù)溶液
用去離子水將10×復(fù)溶液按1:9 體積比進(jìn)行稀釋,用于樣本的復(fù)溶,復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
5.3 樣本前處理步驟:
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.3.1 尿樣處理方法:
直接取20µl清亮尿樣進(jìn)行測(cè)定(渾濁尿樣需要過(guò)濾或經(jīng)4000r/min離心5min,以得到清亮尿樣),暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。
尿樣本稀釋倍數(shù):1 檢測(cè)下限:0.1ppb
5.3.2 組織樣本處理方法一:
稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ,加入6ml復(fù)溶液,充分振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高,可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。取20µl上清液進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):4 檢測(cè)下限:0.4ppb
5.3.3 組織樣本(肌肉和肝臟)處理方法二:
1)稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ,加入8ml乙腈溶液,充分振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min。
2)取上清液5ml,在56℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔抵?干燥;
▲肌肉樣本:
加入1ml 復(fù)溶液混合振蕩30s,取20µl用于分析。
肌肉樣本稀釋倍數(shù):1 檢測(cè)下限:0.1ppb
▲肝臟樣本:
加入2ml正己烷振蕩溶解,再加入1ml 去離子水混合振蕩30s,室溫4000r/min以上離心5min,去除上層;取50µl下層與50µl復(fù)溶液混勻;取20µl用于分析。
肝樣本稀釋倍數(shù):2 檢測(cè)下限:0.2ppb
5.3.4 飼料樣本處理方法:
1)稱取均質(zhì)后的飼料樣品1.0±0.05g,加入10ml甲醇,再加入5g無(wú)水硫酸鈉,振蕩2min;室溫 4000r/min以上離心10min;
2)吸出離心后的上清液1ml,于56℃氮?dú)獯蹈桑? ml復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,再加入1mL正己烷混合30s;室溫4000r/min以上離心5min。
3)取20µl下層進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù):10 檢測(cè)下限:1ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需:將20×濃縮洗滌液用去離子水按1:19稀釋成工作洗滌液。
6.1 編 號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng):加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本20µl/孔到各自的微孔中,然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,再加入80µl/孔的抗體工作液,用蓋板膜封板,輕輕振蕩5秒混勻,25℃反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗 滌:小心揭開(kāi)蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次,每次間隔30秒,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
6.4 顯 色:每孔加入底物液A 50µl,再加底物液B 50µl,輕輕振蕩5秒混勻,25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終 止:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,終止反應(yīng)。
6.6 測(cè)吸光值:用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm)。測(cè)定應(yīng)終止反應(yīng)后在10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0ppb)的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%)= | A | ×100% |
A0 |
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)品的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(20-25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻,洗板要*,在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中,用蓋板膜封住微孔板,避免光線照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒,稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度的降低。不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位(A450nm< 0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液為稀硫酸,避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件:試劑盒于2-8℃保存,不要冷凍。